30 Aralık 1842'de İstanbul'da dünyaya gelmiştir. Ülkenin ilk maden mühendislerinden olan babası İbrahim Ethem Bey, 1877’de sadrazamlığa kadar yükselen bir devlet adamı olarak görev almıştır. Ailenin ikisi kız altı çocuğundan en büyüğü Osman Hamdi’dir.
Osman Hamdi, ilkokul öğreniminin ardından, 1856 yılında Maarif-i Adliye okuluna başlamıştır. Daha 16 yaşındayken yaptığı kara kalem resimlerle çevresinin dikkatini çekmiştir. Babası ile birlikte gittiği Viyana’da, müze ve sergilerle ilgilenmiştir. Oğullarının yurt dışında öğrenim görmesini isteyen babası onu birkaç yıl sonra hukuk öğrenimi için Paris'e göndermiştir. Paris’te kaldığı 12 yıl boyunca hukuk öğrenimini sürdürürken o dönemin ünlü ressamlarından olan Jean-Léon Gérôme ve Boulanger'in atölyelerinde çıraklık yaparak iyi bir resim eğitimi almıştır. Onun Paris’te bulunduğu dönemde Osmanlı Devleti resim öğrenimi için Şeker Ahmet Paşa ve Süleyman Seyyid’i Paris’e göndermiştir. Bu üç kişi, Türk resim sanatının ilk kuşağını oluşturmuştur. Osman Hamdi Bey, 1867 Paris Dünya Sergisi’ne bugün nerede oldukları bilinmeyen “Çingenelerin Molası”, “Pusuda Zeybek “ve “Zeybeğin Ölümü” adlı üç yapıtını göndermiştir. Paris’te tanışıp evlendiği Marie adlı eşi ile 10 yıl evli kaldı, Fatma ve Hayriye adlı iki kızları olmuştur. Yurda döndükten sonra devletin farklı kademelerinde görev almıştır. İlk görevi Bağdat İli Yabancı İşler Müdürlüğü idi. Mithat Paşa’nın Bağdat’a vali olması nedeniyle geldiği bu şehrin çeşitli görünümlerini yansıtan tablolar yapmış ve Bağdat tarihi ve arkeolojisi ile ilgilenmiştir.
Osman Hamdi Bey, müzecilik ve arkeoloji çalışmalarını sürdürürken resim yapmayı hiç bırakmamıştır. Resimlerini genellikle Eskihisar, Gebze’deki evinde geçirdiği yaz aylarında yapmıştır. Türk resminde ilk kez figürlü kompozisyonu kullanan ressamdır. Resimlerinde okuyan, tartışan, özlemini duyduğu Türk aydın tipini ve dışarıya açılmış kadın imgesini ele almıştır. Dekor olarak tarihi yapıları, aksesuar olarak tarihi eşyaları kullanmıştır. "Kaplumbağa Terbiyecisi" (1906), "Silah Taciri" (1908) Osman Hamdi’nin
en ilgi çeken ve özgün eserlerindendir. Birçok resmi İstanbul Resim ve Heykel Müzesi, Londra, Liverpool ve Boston müzelerinde sergilenmektedir.
Sanatçı, 24 Şubat 1910 tarihinde İstanbul Kuruçeşme’deki yalısında hayatını kaybetmiştir. Ayasofya’da kılınan cenaze namazının ardından müzenin bulunduğu Çinili Köşk’e getirilen cenazesi, vasiyeti üzerine Eskihisar’a götürülerek defnedilmiştir. Mezarının başına Bakanlar Kurulu kararıyla iki isimsiz Selçuklu taşı konmuştur. Sanatçının Eskihisar'daki köşkü 1987’den bu yana müze olarak hizmet vermektedir.